medicinos mokslų daktarė Živilė Gudlevičienė

UAB "Medicinos biotechnologijų centras"
Baltijos ir Amerikos Klinika, IVF laboratorija 

Naujausi embrionų tyrimai pagalbinio apvaisinimo technologijų srityje pagal Hipokrato priesaiką – pirmiausia nepakenk (lot. non nocere) !!! 

Truputis istorijos
Pagalbinio apvaisinimo (angl. assisted reproduction) procedūros pasaulyje atliekamos jau pakankamai senai. Moksliniai tyrimai šioje srityje pradėti dar XIX amžiuje. Jau 1890 m. Cambridge universiteto (Anglija) profesorius Walter Heape perkėlė triušiui laboratorijoje išaugintus embrionus. Tai buvo pirmasis žinomas ir aprašytas bandymas. Toliau tyrimai buvo tęsiami, tiriami įvairiausi laboratoriniai gyvūnai. Pirmasis žmogus pasulyje po pagalbinio apvaisinimo procedūros gimė 1978 m. liepos 25 dieną. Tai buvo dviejų garsių mokslininkų Patrick Steptoe ir Robert Edwards ilgų bandymų rezultatas. Tą dieną gimė mergaitė Louise Brown. Taigi, praėjusiais metais sukako 30 metų, kai gimė pirmasis vadinamasis IVF (angl. in vitro fertilization) kūdikis (IVF baby).

Vėliau sekė eilė kitų atradimų, šios procedūros tobulėjo, buvo ieškoma naujų metodų, siekiant pagelbėti poroms, negalinčioms susilaukti vaikų. 1982 metais pasirodė pirmasis pranešimas, kad Australijoje gimė dvyniai iš užšaldytų embrionų. Vėliau, 1983 metais, gimė pirmasis kūdikis po kiaušialąstės donorystės. Kiaušialąstė buvo dovanota moteriai, kuri neturėjo kiaušidžių ir jokiais būdais negalėjo susilaukti savo nuosavo vaikelio, taikant įprastinį pagalbinio apvaisinimo metodą. Vėliau tobulėjo ir pati pagalbinio apvaisinimo technika. Atsirado mikromanipuliacinės procedūros. Jas galima vadinti ir „mikroginekologija“, pagal antologiją su „miktochirurgija“. Tuo tikslu yra naudojami galingi mikroskopai, didinantys net 400 kartų ir specialios mikromanipuliacinės adatos, kurių pagalba atliekamos mikromanipuliacijos su kiaušialąstėmis, spermatozoidais ir pačiais embrionais. 1988 metais atlikta embriono biopsija (paimta viena embriono ląstelė). Profesoriai Alan Trounson ir Leeanda Wilton tyrimui naudojo pelės embrionus. Tačiau buvo įrodyta, kad įmanoma paimti vieną embriono ląstelę ir ją ištirti.   

Vėliau šis metodas labai paplito ir šiuo metu taikomas daugelyje pasaulio IVF laboratorijų kaip ikiimplantancinė genetinė diagnostika (angl. preimplantation genetic diagnosis, PDG).1990 metais pasirodė pirmieji pranešimai apie kitą mikromanipuliacinę techniką, tai pagalbinį embriono dangalo suardymą (angl. assisted hatching). Kadangi atliekant pagalbinio apvaisinimo procedūras yra išstimuliuojama ne vienas, o keli ar keliolika folikulų, tai dažniausiai po IVF procedūros gaunamas ir ne vienas, o daugiau embrionų. Taigi, atliekant šias procedūras atsirado būtinybė ir kažkokiu būdu šiuos embrionus išlaikyti ilgesnį laiką, kad galima būtų panaudoti ateityje. Taip atsirado įvairios embrionų šaldymo technologijos. Iš pradžių embrionai buvo šaldomi, naudojant ilguosius protokolus, užšaldymo procedūra užtrukdavo iki 4-5 valandų. Tačiau vėliau, 1990 m., buvo panaudota vitrifikacija (labai greitas embrionų užšaldymo metodas), kai embrionų užšaldymas užtrunka vos kelias minutes. Apibrėžiant vitrifikaciją, galima sakyti, kad tai yra skysčio kietėjimas (stiklo formavimasis) žemoje temperatūroje be ledo kristalų formavimosi, naudojant labai mažus kiekius krioprotektorių ir šaldant dideliu greičiu. Svarbiausias pranašumas vitrifikacijos metu, skirtingai nuo lėto šaldymo – šaldomas embrionas virsta į stiklą panašios struktūros („sustiklėja“), t.y. šio proceso metu nesiformuoja ledo kristalai. Pridėjus krioprotektorių, ląstelėje esantis vanduo šaldomas iki stiklo struktūros be jokių ledo kristalų formavimosi. Tai ypač svarbu šaldant embrionus, nes ledo kristalai gali pažeisti embrioną (ar kitas šaldomas ląsteles, audinius bei organus). Vitrifikuoti embrionai, vėliau juos atšildžius, pasižymi ženkliai geresniu išgyvenamumu, juos patalpinus žymiai dažniau nustatomas nėštumas moterims ir gimsta didesnis procentas gyvų naujagimių (t.y. rečiau įvyksta persileidimas), palyginti su lėto užšaldymo metu užšaldytais ir atšildytais embrionais. Mes galime pasidžiaugti, kad praėjusiais metais Lietuvoje taip pat gimė pirmasis kūdikis po embriono vitrifikacijos, procedūra buvo atlikta Baltijos ir Amerikos klinikoje (dr. Živilė Gudlevičienė ir gyd. Odeta Gabrėnaitė-Kazlauskienė). Šiuo metu jau yra ne vienas vaikelis Lietuvoje, gimę po tokios procedūros.Tuo metu vis dar buvo sprendžiama problema, kaip padėti poroms, kurių vyrų spermoje randama per mažai spermatozoidų ir jie nesugeba apvaisinti kiaušialąstės net ir suliejus lytines ląsteles laboratorijos sąlygomis. 1992 metais pasirodė pirmasis pranešimas, kad Briuselio mokslininkų grupei, vadovaujamai profesoriaus Gianpiero Palermo, pavyko sėkmingai atlikti intracitoplazminę spermatozoido injekciją (ICSI), po kurios sėkmingai gimė pirmasis ICSI vaikas. 

Vėliau ICSI buvo atliekama ir toms poroms, kai vyrų spermoje nėra randama nė vieno spermatozoido – spermatozoidai tiesiogiai operacijos būdu buvo gaunami iš vyro sėklidės ar sėklinio virželio. Toliau buvo tobulinama ir šaldymo technika – šaldomi ne tik embrionai, bet ir kiaušialąstės, spermatozoidai, Šiuo metu jau yra šaldomi ir kiaušidžių bei sėklidžių audiniai, užšaldomi ir visi organai. Šios procedūros reikalingos tuo atveju, jei asmeniui yra diagnozuotas sėklidžių ar kiaušidžių vėžys. Tobulėjant vėžio gydymo metodams ir ilgėjant onkologinių pacientų išgyvenamumui, prieš operaciją ar spindulinę terapiją užsišaldžius organus ar audinius (sėklidės bei kiaušidės), yra didelė tikimybė, kad jie galės ateityje ne tik susilaukti, bet ir sėkmingai išauginti savo vaikus. Daugelyje šalių taip pat egzistuoja ir onkologinių pacientų IVF programos, kurių tikslas – vaisingumo išsaugojimas vėžiu sergantiems pacientams. 

Visų pirma – nepakenk
Aptarėme daugelį pagalbinio apvaisinimo procedūrų. Daugelis jų taikoma ir Lietuvoje.
Jei trumpai paminėsime:
·       IUI – paruoštos spermos paruošimas ir suleidimas į gimdos ertmę;
·       IVF (in vitro fertilization)  - įprastinė apvaisinimo mėgintuvėlyje procedūra;
·       ICSI  - intracitoplazminė spermatozoido injekcija;
·       TESA - transepiderminė spermatozoidų aspiracijaiš sėklidės;
·       assisted hatching (angl.) - pagalbinis embriono dangalo suardymas;
·       embrionų užšaldymas (įprastinis lėtas užšaldymas ar vitrifikacija) ir atšildymas. 

PGD Lietuvoje nėra atliekama, nors yra taikoma daugelyje pasaulio šalių. Tačiau vėlgi nesenai pradėta kalbėti apie galimos embriono rizikos ir naudos santykį, atliekant šį tyrimą. Nurodoma, kad ir atliekant PDG, neišvengiama klaidų. Dažniausia tos klaidos yra tos, kad net ir nenustačius tam tikrų defektų, yra patalpinami „nesveiki“ embrionai su įvairiais chromosomų ir genų defektais. Juk šio tyrimo metu yra tiriamos tik dažniausiai pasitaikantys chromosomų defektai, o dauguma kitų lieka neištirti (angl. misdiagnosis). Populiariausio FISH metodo metu šiuo metu galima ištirti tik 15 chromosomų. Taip pat yra ir atvirkštinės galimybės tikimybė – embrionai, kurie buvo „išbrokuoti“ kaip turintys defektų, iš tiesų šių defektų neturi. Tai gali atsitikti ir dėl tyrėjo nekompetentingumo ar kitų priežasčių. Taip pat pastaruoju metu vis dažniau kalbama apie tą žalą, kurią padarome, jei iš embriono paimam viena ar dvi ląstelės, ir jis toliau paliekamas augti. Vis dėl to yra prarandama dalis genetinės embriono medžiagos. Todėl šiuo metu yra labai griežtos indikacijos, kada yra būtina atlikti PGD, ir tai tikrai nėra taikoma visoms poroms, kurios pageidauja tai atlikti. O poros turi būti labai gerai informuotos apie galimą šios procedūros žalą, nes po šių procedūrų gali gimti kūdikiai su retomis chromosominėmis ligomis ar sindromais. Taip pat daugelyje šalių jis yra nepriimtinas kaip INVAZINIS (t.y. žalojantis) embrionų ištyrimo metodas.

Panašių diskusijų sukelia ir pagalbinio embriono dangalo suardymo (assisted hatching) procedūra. Yra keli būdai šiai procedūrai atlikti.

• Mechaninis dangalo suardymas
• Naudojant tyroidinę rūgštį
• Naudojant lazerį
• Naudojant fermentą pronazę

Šis metodas (assisted hatching) labai populiarus buvo vos tik jį atradus. Buvo manoma, kad iš tiesų, suardžius embriono dangalą bus palengvintas jo „išsilukštenimas“ ir prilipimas prie gimdos sienelės. Tačiau ir šis metodas, kaip „panacėja“ jau nueina nuo savo populiarumo arenos. Vėlgi turi būti apibrėžtos labai griežtos indikacijos, kada tai galima atlikti. Literatūra nurodo, kad embriono sienelė turi būti storesnė, nei 15 mikrometrų, pacientėms, kurios turi padidėjusį FSH (folikulus stimuliuojantis hormonas), vyresnėms moterims ir kt. Bet pirmiausia šis dangalas iš tiesų turi būti storesnis, jį reikia išmatuoti. Tenka girdėti, kaip pacientės diskutuoja, jog laboratorijoje dirbantis specialistas pasakė, kad embrionai neįsitvirtino, nes jų sienelė buvo stora. Visos diskusijos apie storas embriono sieneles, jų nepamatavus, iš tiesų neturi prasmės. Dažniausiai ilgesnį laiką laboratorijoje paauginti embrionai patys išsilukštena iš savojo dangalo (blastocistų auginimas 5-6-ą parą, matoma laboratorijoje). Taigi šis metodas taip pat dėl savo invazyvumo (embriono pažeidimo tikimybės) yra jau net ir atsisakomas kai kurių IVF laboratorijų pasaulyje. Net ir vadinamas saugiausias metodas, panaudojant lazerį, nėra saugus. Lazerio ekspozicija užtrunka kelias sekundės dalis, bet neteisingai sukoncentravus lazerio spindulį ar neteisingai sufokusavus embrioną pažeidimo rizika labai ir labai didelė.                    

Todėl dabar pasaulis vėl suka naujausiu embrionų tyrimo keliu – NEINVAZINIAI embrionų tyrimai. Pastaruoju metu labai išpopuliarėjo proteomika ir metabolomika.                    

Proteomika (angl. proteomics) – tai yra visų genomo koduojamų baltymų struktūros ir funkcijos nustatymas. Kitaip tariant, tai yra viso organizmo baltymų rinkinio analizė. Yra tiriami baltymų pokyčiai vystantis embrionui ir sąveikaujant jam su aplinka, kintant pačiam embrionaui. Pagal šių baltymų pokyčius yra atrenkami patys gyvybingiausi embrionai, turintys didžiausią išgyvenimo ir įsitvirtinimo į gimdos sienelę tikimybę. Tyrimo metodas neinvazyvus, t.y. nepažeidžia embriono, nes yra tiriama terpė, kurioje embrionas vystosi. Taip pat galima tirti ir folikulinį skystį, ne tik embriono aplinkos terpę. Tuomet bus nustatomos kiaušialąstės funkcijos bei būsimojo embriono galimybės.                   

Metabolomika, savo ruožtu, tiria embriono metabolizmo (embriono apykaitos produktų) koncentracijas ir jų kitimus embriono vystymosi metu. Taip pat tai yra labai pažangus tyrimo metodas, nes yra neinvazinis, netraumuojantis embriono. Tiriami embriono apykaitos produktai jo aplinkoje, t.y. mitybinėje terpėje. Tiriami embriono išskiriami produktai į aplinką, vadinamosios sekretomos.                    Taigi šiems, neinvaziniams embrionų tyrimo metodams, mokslininkų šnekamojoje kalboje vadinamos „–omikoms“, šiuo metu garsiausios pasaulio laboratorijos skiria ypatingą dėmesį.                    

2009 metų vasarą Baltijos ir Amerikos klinikos vyresnioji embriologė medicinos mokslų daktarė Živilė Gudlevičienė ir akušerė ginekologė Odeta Gabrėnaitė-Kazlauskienė stažavosi Birmingemo (Anglija) Moterų klinikų Pagalbinio apvaisinimo laboratorijoje (Asissted Conception Unit, Birmingham Women's Hospital, http://www.bhamivf.org.uk/). Ši laboratorija atnaujinta 2006 metais ir yra viena iš nedaugelio Europoje ir vienintelė centrinėje Anglijoje, dirbanti pagal sterilios laboratorijos („clean room“) principus. Laboratorijoje dirbama su specialiais rūbais, panašiais į skafandrus. Suteikiama maksimali apsauga ne tik emnrionui, bet ir laboratorijos specialistui. Tokioje laboratorijoje gaunami puikūs pastojimo rezultatai. Šios laboratorijos vyriausiasis embriologas (Senior Embryologist) Julian Allsopp ir ten dirbanti lietuvė embriologė Ingrida Krasauskaitė (dr. Živilės Gudlevičienės mokinė) supažindino su vykdomais embrionų metabolomikos tyrimais, tam reikalinga aparatūra ir darbo metodais. Neinvaziniai embrionų tyrimo metodai greitu laiku bus pradėti ir Lietuvoje.